Két év telt el, amióta a csendes Peter Parker (Tobey Maguire) elhagyta nagy szerelmét, Mary Jane Watsont (Kirsten Dunst), és vállalta a szuperhősléttel járó felelősséget. Peternek számos új nehézséggel kell szembenéznie, miközben arra törekszik, hogy megteremtse az egyensúlyt két élete között - nappal szorgalmas egyetemista, éjjel pedig a szuperhős szerepét ölti magára. Azok az emberek, akik a legfontosabbak Peter számára, mind veszélyben vannak, attól a pillanattól, hogy összeütközésre kerül sor a gonosz Doc Ockkal. Peter egyre nehezebben bírja Mary Jane nélkül, és egyre erősebb késztetést érez, hogy a kettős életnek és a titkolódzásnak véget vessen. Közben M.J. már továbblépett és éli a maga életét: színészkedik és férfi is van az életében. Peter legjobb barátja, Harry Osborn (James Franco) a Pókemberen még mindig bosszút szeretne állni, mert őt tartja felelősnek apja haláláért.